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purificacion de proteinas

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PURIFICACI N Y CARACTERIZACI N DE PROTE NAS Pasos a seguir Elegir la fuente de la prote na Extraer la prote na Centrifugar Realizar una precipitaci n salina Realizar una di lisis Purificar Determinar secuencia Extracci n de la prote na Lisis celular: usa una soluci n hipot nica. La membrana se rompe debido a la diferencia osm tica. Extracci n de la prote na Destrucci n mec nica. Se puede realizar por: Homogeneizaci n Molienda (con arena o al mina) Presi n Sonicaci n (aplicaci n de ultrasonido) Extracci n de la prote na Congelaci n-descongelaci n. La ruptura de la c lula se produce por el cambio brusco de temperatura. De -56 C a 37 C; o de -196 C (nitr geno l quido) a 25 C Centrifugaci n Se llama tambi n fraccionamiento. Se realiza una centrifugaci n a 10000 - 15000 rpm. El sobrenadante contiene las prote nas solubles. Centrifugaci n Precipitaci n Salina Se manipula la solubilidad de las prote nas debido a la carga neta, la polaridad y la fuerza i nica. Generalmente se emplea (NH4)2SO4 1M soluble 3M insoluble Di lisis Retirar el (NH4)2SO4 y volver a solubilizar la prote na. Extracto crudo, listo para purificaci n Purificaci n Cromatograf a columna. Filtraci n en gel La separaci n se basa en el tama o de las part culas. Las mas grandes eluyen primero y las m s peque as se retienen el la fase s lida. Purificaci n Cromatograf a de Intercambio I nico La separaci n se debe a la carga neta de las prote nas. Intercambio ani nico Intercambio cati nico Si la resina de relleno tiene carga positiva, eluir n las part culas cargadas positivamente y se retendr n las part culas cargadas negativamente. Si la resina de relleno tiene carga negativa, eluir n las part culas cargadas negativamente y se retendr n las cargadas positivamente. Purificaci n Cromatograf a de afinidad Se basa en la capacidad que tienen algunas prote nas de unirse fuertemente pero no covalentemente a ciertas mol culas llamadas ligandos. Identificaci n Electroforesis Se produce la separaci n por efecto de un campo el ctrico y filtraci n en gel. Electroforesis Electroforesis Enfoque Isoel ctrico Composici n de amino cidos Hidr lisis: Hidr lisis cida Hidr lisis b sica Cromatrograf a (PITC) Asn y Gln se convierten en sus cidos. Se determina Asx y Glx El Trp se degrada totalmente Se pierde entre el 5-10% de Ser, Thr y Tyr. Degradaci n de Edman pH 9 F3C2O2H Hidr lisis Parcial CianoBromuro Hidr lisis Enzim tica Secuenciaci n Determinaci n de amino terminal: Degradaci n de Edman, reacci n de Sanger (2,4-dinitrofluorobenceno), Dansilaci n (cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5sulfonilo) Determinaci n del Carboxi terminal: hidrazina, carboxipeptidasa A Reactivos para identificar NH2 terminales 2,4-dinitrofluorbenceno NO2 NO2 F FDNB Despu s de la hidr lisis Sanger C OOH NO2 R Amarillo, se extrae con cloroformo (los dem s productos de hidr lisis ionizados no se extraen) NO2 Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo C H NH DNS-Cl Cloruro de dansilo Despu s de la hidr lisis CH3 CH3 CH3 N O S Cl O CH3 An logo a FDNB pero fluorescente (detecta cantidades m nimas) C OOH N O R S NH O C H Reactivos para identificar COOH terminales Hidrazinolisis NH2-NH2 Despu s de la hidr lisis NH2-NH2 CO NH NH2 R NH2 C H El terminal queda libre y los dem s como hidracidas COOH R NH2 C H Ejemplo Determinaci n de grupos terminales: Amino terminal: Leu Carboxi terminal: Lys Hidr lisis parcial y secuenciaci n por Edman: Quimotripsina: His Met Thr Met Ala Trp Leu Asn Asp Phe Val Lys Cianobromuro: Leu Asn Asp Phe His Met Ala Trp Val Lys Thr Met Hidr lisis Enzim tica

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